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药物对肾小球抑制作用的对比分析

时间:2017-12-15 21:00:07 来源: 代写硕士论文
  论文关键词:肾小球 药物 作用 对比

  论文摘要:采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术,观察具有降逆泄浊、益气活血功效的中药肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)的作用,该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用,但不及肾康注射液作用明显。结论,肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。 
  近年来,随着对肾小球硬化机制认识的不断深入,肾小球系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖,减少ECM的堆积,拮抗细胞因子的不良作用,已成为防治肾小球硬化,延缓CRF病情进展的重要环节。 
  一、对比研究使用的材料 
  选用的材料 
  1、肾组织来源系我校附属医院妇产科孕5月引产胎肾。 
  2、药物与试剂肾康注射液(SKI)由大黄、丹参、红花等组成,成都中医药大学附属医院提供,每毫升含原生药0.3g;苯那普利(Benayzepril)由瑞士诺华制药有限公司生产,批号:012200;V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品;RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品;小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均购于北京中山生物技术有限公司;LN、Col Ⅳ放射免疫分析试剂盒,均购于上海海研医学生物技术中心。 
  3、主要仪器CO2孵箱(TYPE4型)德国HERAEUS公司生产;倒置显微镜(TOKYO)日本OLYMPUS公司生产;洁净工作台(月坛牌)北京半导体设备一厂生产;酶标分析仪(MODEL2550)美国BTO-RAD公司生产;FT-613自动计数125 I放免测量仪,北京核仪器厂生产。 
  二、研究采用的方法 
  1、MC培养与鉴定无菌取胎肾,分离提取肾皮质小球组织,按照于力方等方法(1)取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养,实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC,无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。 
  2、分组及MC上清的收集吸取培养的第5代MC培养瓶中液体,加胰酶1ml,置孵箱(5%CO2、37℃)中消化3min,加10% FCS 1640终止液2ml,抽吸于离心管中,800rpm,离心3min,弃上清,加15% FCS 1640培养液于离心管中,吹打,混匀。用计数板计数后,倾入加样槽中,用8导加样枪,按每孔200μl,密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组(简称组Ⅰ)、苯那普利组(简称组Ⅱ)、肾康注射液高浓度组1、2(简称组Ⅲ、组Ⅳ)、肾康注射液中浓度组1、2(简称组Ⅴ、组Ⅵ)、肾康注射液低浓度组1、2(简称组Ⅶ、组Ⅷ),共8组(列),每列6孔,待细胞贴壁24h后,每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外,其余各组分别依次加入苯那普利10-3mmol/L及肾康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml,待刺激48h后依次收集上清待测。 
  3、测定ECM中FN的含量用双抗体夹心ELISA法,0.5mg/ml鼠 抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板,50μl/孔铺板,4℃过夜,甩去。用PBS-吐温20洗涤液洗板3次,每次3min,间隔2min,控干。每孔加1%BSA封闭液100μl,37℃,1h后甩去,控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl,37℃,3h后甩去,洗板4次后,加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA?PBS1∶1000稀释)50μl/孔,室温放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA?PBS1∶1000稀释)50μl/孔,室温放置50min。再洗板4次后,每孔加入OPD显色液50μl,预热酶标仪,用2M H2SO4终止液50μl/孔终止,立即在492nm波长读数,并记录OD值。 
  4、ECM中LN、Col Ⅳ含量的放射免疫法(RIA)测定采用竞争法,将缓冲液稀释10倍,分别将125 I-LN、抗LN血清、125 I-ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用缓冲液稀释,将待测上清分别与125 I-LN、125 I-ColⅣ及相应的抗血清混匀,4℃过夜反应,加二抗4℃反应60min,离心3500r/min 10min弃上清,125 I放射免疫测量仪计数。 
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