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人类免疫缺陷病毒实验室检测技术研究进展

时间:2017-12-10 12:00:12 来源: 代写硕士论文
【关键词】  人类免疫缺陷病毒  检测技术  艾滋病
        人类免疫缺陷病毒(HIV)检测的主要目的是用于获得性免疫缺陷综合症(AIDS)即艾滋病的病原体诊断。本文就近年来HIV检测的研究进展综述如下。
        1 抗原检测
        常用的HIV抗原检测是P24抗原技术。机体感染HIV后,P24抗原是最早能从血清中检出的病原学标志,通常感染后约2~3周即可检出,1~2月左右进入抗原高峰期,然后随着HIV抗体的产生形成抗原抗体复合物。由于抗体的中和作用,P24抗原浓度不断下降直至难以测出的水平时,标志着HIV感染者进入无症状期。当HIV抗原再度在血清中增长,意味着病毒的大量繁殖和免疫系统的破坏,提示感染者已经或即将进入艾滋病发作期。因此,HIV P24抗原检测主要是作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断。其他新的抗原检测方法有:①免疫复合物裂解检测法。②超敏感酶免疫测定法。③免疫吸附电镜法。④线性免疫酶测定和罗奎尔艾滋病酵素免疫法。⑤荧光联结抗原定量法。
        2 抗体检测
        常用的HIV抗体检测技术包括初筛试验和确证试验,酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、金免疫渗滤实验、快速检测和明胶颗粒凝集试验仅作为筛查试验,免疫印迹试验、条带免疫实验、放射免疫沉淀实验作为确认试验。
        2.1 HIV抗体初筛试验
        2.1.1 ELISA 适用于大批量标本的检测,目前是大、中、小型医院实验室筛查HIV抗体的主要技术手段。ELISA的基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面,再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应,加入酶底物及色原后呈色,呈色程度用吸光度(A)值表示,所测A值与待测抗体或抗原的水平呈相关关系,读取结果需要用酶联检测仪。作为检测HIV抗体的最主要方法,其试剂在经过了第1代、第2代、第3代后,已经发展到第4代检测试剂[1,2]。目前使用第4代酶免法测HIV抗体试剂,敏感度几乎为100%,特异性在98.1%~99.8%之间。由此可见,提高敏感性、特异性,缩短窗口期和简便快捷是HIV检测试剂未来发展的主要趋势。
        2.1.2 免疫荧光法(IFA)  其原理是用H9或HUT 78培养细胞作为载体,用HIV感染细胞。该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上,固定,制备为抗原片,加入待检血清,待检血清中的HIV抗体与抗原结合后,再与荧光素标记的抗人Ig结合,在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。该方法的优点是操作简便、敏感性高、特异性比ELISA法高。但缺点是非特异荧光较难去除,所以只能用于HIV抗体初筛实验,阳性结果还需要确证实验证实。
        2.1.3 金免疫渗滤实验(GIFA) GIFA是以酶作标记物和以胶体金为标记物用于快速检测艾滋病毒抗体的渗滤实验。其方法是将胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗原抗体反应在固相上迅速完成,然后用胶体金标记的SPA直接显色。这些方法具有快速简单、不用仪器、目测观察结果的优点,在临床检测中广泛应用。
        2.1.4 快速检测(RT)  HIV抗体快速检测试剂是以胶体金或硒为标记物,硝酸纤维素膜为载体,采用层析形式进行固相免疫测定的技术为原理制备的。该类试剂敏感性较酶联免疫试剂低,其使用范围受到一定限制。但该类试剂比较稳定,可以在室温下保存一年或更长的时间,且操作简单,不需要仪器设备,尤其适用于单份标本的测定。快速检测试剂一般在10~30min内测出结果。
        2.1.5 明胶颗粒凝集试验(PA)  该方法原理是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体,与待检标本混匀后在室温下作用,当待检标本含有HIV抗体时,经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应,根据明胶颗粒在孔中的凝聚情况判读结果。它的代表方法有以下几种:(1)斑点EIA。(2)斑点免疫胶体金(或胶体硒)快速试验。(3)艾滋病唾液检测卡。(4)尿液HIV检测卡。(5)滤纸干血片法。
        2.2 HIV抗体确认试验
        2.2.1 WB  免疫印迹或免疫转印技术是在DNA印迹术发展而来的新型免疫生化板术,WB是将HIV病毒蛋白通过SDS  PAGE把分子量大小不等的蛋白带分离开来,再把这些已经分离的不同蛋白转移到硝酸纤维素膜上,再将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。待检血清样本用稀释液稀100倍,将其加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应。血清中若含有抗HIV,就会与膜上的抗原结合,冲洗掉多余的抗体,然后加入抗人IgG酶结合物并温育,洗涤后加入底物,有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况来判断结果。 
        2.2.2 条带免疫试验 条带免疫试验的原理及操作方法与WB基本相同,区别在于条膜的来源和组成不同。该实验的优点是检测时抗干扰强,特异性高,克服了WB实验中使用病毒裂解产物可能产生的同相载体上某些重要抗原不足。唯一缺点是合成抗原不能糖基化,它的立体构象与天然抗原有一定差异,在某种程度上影响了HIV抗原检测抗体的能力。
        2.2.3 放射免疫沉淀试验(RIPA) 本法是将病毒的蛋白与待测血清混合,如有HIV抗体,则同位素标记的HIV蛋白与之结合产生沉淀,沉淀物用配套的缓冲液和十二烷基硫酸(SDS)洗脱,即可将病毒抗原分离,最后病毒蛋白用放射自显影鉴定,同时用已知的分子标记物比较。此方法敏感性和特异性比WB实验方法高,但费时且技术难度大,目前难以普及推广。
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