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p15mRNA在肺癌组织中的表达及其意义

时间:2017-10-23 05:00:11 来源: 代写硕士论文

                     作者:戚好文,郝光辉,李焕章 


【关键词】  肺肿瘤
    关键词: p15基因;肺肿瘤;原位杂交 
    摘 要:目的  研究抑癌基因p15mRNA在肺癌组织中的表达,揭示p15基因的失活与肺癌的发生和其组织类型的相关性. 方法  对病理确诊的93(非小细胞肺癌65,小细胞肺癌28)例肺癌病理组织切片,采用p15cDNA探针以原位杂交组织化学方法检测p15mRNA在肺癌组织中的表达水平. 结果  p15mRNA阳性表达于肺癌组织细胞质或细胞核中,在细胞质中可见到较多的棕黄色颗粒,而细胞核内棕黄色颗粒相对少见.p15mRNA的阳性表达率:非小细胞肺癌为46%(30/65),其中鳞癌46%(23/50),腺癌47%(7/15).小细胞肺癌20%(5/25).非小细胞肺癌p15mRNA阳性表达率高于小细胞肺癌;高分化的鳞、腺癌阳性表达率高于同组中的低分化的鳞、腺癌(P<0.05). 结论  p15基因的失活与肺癌的发生密切相关,而且其失活程度与肺癌组织类型的恶性程度呈负相关.
      
  Keywords:p15gene;lung neoplasms;in situ hybridization
     
  Abstract:AIM To show the association of inactivation of p15gene in lung cancers with pathogenesis and variation of lung cancer tissues by studying the expression of p15mRNA in lung cancers.METHODS There were93cases,of which65were NSCLC and28were SCLC,confirmed by pathologi-caly.The expression of p15mRNA in pathological sections of lung cancer was examined using p15cDNA and in situ hy-hyidizatino-histochemistry method.RESULTS In93lung cancers,positive expression of p15mRNA was found located in the cytoplasm or nuclei,with quite a lot of brown-yellow granules seen in cytoplasm,but only a few in nuclei.In NSCLC cases the positive rate of p15mRNA expression was46%(30/65),of which,lung squamous carcinoma and lung adenocarcinoma were46%(23/50)and47%(7/15)respec-tively,and the positive rate in SCLC cases was20%(5/25).The positive rate of p15mRNA expression was higher in NSCLC than in SCLC(P<0.05).The positive rate in well-differentiated lung squamous carainomas and lung adeno-carainomas was higher than that in poorly differentiated ones(P<0.05).CONCLUSION The results showed that p15inactivation might be strongly related to pathogenesis of lung cancers and the degree of p15inactivation might be negatively associated with the malignant degree of the lung cancer tis-sues.
     
  0 引言
     
  探讨抑癌基因的失活在肺癌发病机制中的作用是目前研究中的一个热点,抑癌基因p15/MTS2(简称p15基因)[1] 编码p15蛋白属于INK4蛋白家族,它作用于细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)与细胞周期蛋白(cyclin)复合物,特异性抑制CDK4及CDK16激酶活性,阻止其磷酸化R6蛋白,限制细胞由G1期向S期转变,减少细胞增殖.以前我们[2] 应用免疫组织化学方法证实了p15蛋白与肺癌的相关性.现运用mRNA原位杂交方法检测p15mRNA在肺癌组织中的表达水平,以进一步认识p15基因与肺癌之间的关系.
     
  1 材料和方法
     
  1.1 材料  病理标本来源为西京医院病理科1997-01/1998-02原发性支气管肺癌患者手术或纤维支气管镜活检组织检查标本,共计93例,均经40g・L-1 多聚甲醛固定及石蜡包埋、HE染色、光镜观察证实.根据1997年世界卫生组织肺癌分类标准进行组织学分类:非小细胞肺癌(NSCLC即鳞癌加腺癌)65例,其中肺鳞癌50(高分化10,中分化29,低分化11)例,肺腺癌15(高分化3,中分化9,低分化3)例.小细胞肺癌(SCLC)28例.p15基因cDNA探针,原位杂交组织化学试剂盒,DAB试剂盒及APES试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司.
     
  1.2 方法  肺癌组织病理切片经二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水.静置于新鲜配置30mL・L-1 的H2 O2 溶液中(室温24℃,10min)以灭活组织切片中内源性过氧化氢酶.加入1∶1000比例稀释蛋白酶K,切片置于37℃15min以暴露mRNA核酸片段.含地高辛标记p15cDNA探针的杂交液于90℃~95℃水浴10min后置于碎冰3min.滴加10μL冷却p15mRNA原位杂交液干切片,37℃恒温杂交20h.滴加5g・L-1 BSA液,24℃封闭20min,加入1∶500小鼠抗地高辛抗体,25℃孵育30min后洗涤,加1∶100生物素化山羊抗小鼠IgG,25℃静置20min后,洗涤,加SABC复合物,25℃静置20min.DAB显色,苏木精复染,常规脱水透明后以中性树胶封片.
     
  1.3 原位杂交组织化学染色对照及阳性结果判断以博士德公司提供的已知p15mRNA原位杂交阳性染色的膀胱肿瘤组织切片作为阳性对照.以0.5mol・L-1 ,pH7.4的PBS液代替含有p15cDNA探针的原位杂交液作为阴性对照.
    以肿瘤细胞质中出现棕黄色颗粒状染色为阳性染色细胞.选取5个高倍视野(×400)肿瘤组织细胞,确认视野中无阳性染色的正常组织细胞,平均每视野阳性细胞计数占肿瘤细胞总数5%以上为阳性染色,余为阴性染色.盲法观察切片染色结果,计算阳性染色例数.
    
  统计学处理:采用四格表资料及2×K表资料的χ2 检验方法进行统计学分析.
     
  2 结果
     
  2.1 肺癌组织病理切片中染色情况  p15mRNA表达阳性的肿瘤细胞质中可见到大量的棕黄色染色颗粒,而细胞核内棕黄色颗粒相对少见(Fig1A~C).
         
  图1 略
     
  2.2 原位杂交检测结果  不同组织类型肺癌p15mRNA阳性表达率:NSCLC为46%(30/65),其中鳞癌46%(23/50),腺癌47%(7/15);SCLC为20%(5/25).NSCLC p15mRNA阳性表达率与SCLC阳性表达率进行比较,χ2 =5.0875,P<0.05,二者具有显著差异.NSCLC中肺鳞癌与肺腺癌之间p15mR-NA阳性表达率进行比较,χ2 =0.0528,P>0.05,无显著差异.
     
  2.3 不同分化程度的肺鳞癌及肺腺癌p15mRNA表达  肺鳞癌50例,其中高分化、中分化及低分化分别为8,28及10例,而相应p15mRNA阳性表达例数分别为6,13及2例.肺腺癌15例,其中高分化、中分化及低分化分别为3,9及3例,而相应p15mR-NA阳性表达例数分别为3,5及0例.肺癌恶性程度的高低一般根据肺癌的类型和分化程度来化分,按类型区分是小细胞肺癌>腺癌>鳞癌;按细胞分化程度区分,是低分化>高分化.本研究p15mRNA表达结果也证实了恶性程度越高,其p15mRNA阳性表达率越低;恶性程度越低,p15mRNA阳性表达率也越高,如小细胞肺癌和低分化的鳞、腺癌.总之p15mRNA表达与肺癌的恶性程度呈负相关.

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