用户注册|RSS订阅
位置: 主页 > 代写硕士论文 > HPV感染阳性角朊细胞的原代培养及生物学特性研究

HPV感染阳性角朊细胞的原代培养及生物学特性研究

时间:2017-10-22 09:00:05 来源: 代写硕士论文
                            作者:严泉剑 张菊 闫小君 段杰 张宇梅 赵锦荣 苏成芝 

【关键词】  乳头状瘤病毒
  关键词: 乳头状瘤病毒,人;角蛋白细胞;细胞,培养的;生物学特性
     
  摘 要:目的  培养人原代乳头瘤病毒(HPV)感染阳性皮肤角朊细胞,观察其生物学特性. 方法  取患者新鲜疣体及正常包皮皮肤组织,用胰酶消化法培养角朊细胞,观察其生长情况,绘制细胞生长曲线图,用PCR及原位杂交方法检测上述细胞. 结果  HPV阳性角朊细胞(PK)在1640液中生长情况良好,增殖速度较正常角朊细胞快. 结论  PK细胞在1640液中生长情况良好,适合作为HPV感染动物模型用于进一步研究.
      
  Keywords:papillomavirus,human;keratinocytes;cells,cul-ture;biologic characters
     
  Abstract:AIM To investigate the biologic characters of HPV positive keratinocytes in culture.METHODS By pro-tecting the cell growth curve,we studied the distinctness of growth character between HPV positive keratinocytes(PK)and normal keratinocytes(NK).HPV positive keratinocytes were confirmed by PCR and DNA hybridization.RESULTS PK proliferated more quickly than NK,and grew well in RP-MI1640midium but did not form clone.CONCLUSION PK grew well in RPMI1640midium in which immunocell grows well,so is a suitable animal model for HPV infection.
  0 引言
     
  人乳头瘤病毒(HPV)是一种常常感染复层上皮细胞,并引起乳头瘤样改变及良、恶性肿瘤的小DNA病毒,其中常见的HPV16,18,30,31,42,51~54等9型与恶性肿瘤相关,其治疗和预防有重要意义,传统的治疗方法复发率甚高,目前最有希望的疗法是主动免疫治疗.我们培养HPV感染阳性角朊细胞,初步研究其生物学特性.
     
  1 材料和方法 
  1.1 材料
     
  1.1.1 试剂  RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品,胎牛血清购自华美生物工程公司.鼠尾胶原按Montesano等[1] 所述方法制得.新鲜成年SD大鼠鼠尾,在700mL・L-1 乙醇中浸泡20min后抽出鼠尾胶丝,剪碎浸入4℃,5mL・L-1 的无菌乙酸溶液中混匀48h,(150mL/tail),胶原溶液在4℃,10000g离心15min,用5mL・L-1 的乙酸溶液将胶原浓度调整至3g・L-1 ,终浓度用Beckman Du640紫外分光度仪测定.培养液中氯化钙的终浓度为0.04mmol・L-1 .
     
  1.1.2 HPV感染阳性角朊细胞  来自1例20岁男性尖锐湿疣患者包皮部位病损和1例22岁女性阴道前壁病损患者.正常人表皮角朊细胞来自门诊2例单纯包茎患者环切术后包皮内外板皮肤. 
  1.2 方法
     
  1.2.1 细胞培养  胰酶消化法分别获得患者疣体部位及正常部位角朊细胞,以1×105 细胞数接种于涂布鼠尾胶原的100mL细胞培养瓶,培养条件为50mL・L-1 CO2 ,37℃.培养基为RPMI1640培养液含水量100mL・L-1 小牛血清和抗菌素(青霉素0.1μ・L-1 ,链霉素0.1μ・L-1 ).
     
  1.2.2 计数法绘制细胞生长曲线  实验分组,以下测量参数,来源于男性的HPV阳性角朊细胞为HPV PKCm组,来源于女性的为HPV PKCf组,正常人角朊细胞分别为HPV NKCm和HPV PNKCf组.用2.5g・L-1 胰酶消化第3代单层培养的角朊细胞,用培养液制成单细胞悬液,阳性组每孔4×104 个细胞、阴性组每孔8×104 个细胞接种于24孔板,每孔加入1mL培养液.常规培养,3d换液1次,每3d测量1次,每次3个复孔,连续24d,计数方法为2.5g・L-1 胰酶消化后于镜下用血小板计数器计数,所得数据用Microcal Origin软件绘制细胞生长曲线.
     
  1.2.3 形态学观察及特性检测  ①倒置显微镜进行动态观察或爬片、涂片染色后观察;②原位杂交HPV地高辛标记的DNA探针(博士得,MK1040),用于检测HPV感染阳性的培养角朊细胞,阳性对照为西京医院病理科HPV阳性患者病理切片,阴性对照为正常人皮肤切片,方法依照试剂盒说明;③软琼脂培养35mm培养皿(NUNC,丹麦)5个,琼脂糖(Agarose,Promega V312A)7g・L-1 (底层)和3.5g・L-1 (表层),接种培养细胞1000个每皿,每10d观察细胞克隆数,共40d;④PCR检测HPV11,16通用引物为MY09和MY11[2] .HPV11,16的特异性引物根据Oligo软件设计,由上海生物工程公司合成.模板DNA是HPV感染阳性的培养角朊细胞提取物.PCR参数:94℃,50℃和72℃,各30s,25个循环.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,与Mark对比.
    
  2 结果
     
  HPV PKC组原代培养初期,在低倍镜下,基底细胞游离在培养液中,呈透明小圆细胞,培养液中还可见有棘细胞及角质细胞,低倍镜下为不透明的细胞及扁平细胞,培养5d后,基底细胞开始占优势.传代接种于24孔板,每个孔中接种细胞数为4×104 ,于接种后18~24h即可见细胞贴壁,并聚集成大小不等到集落.在其边缘部见新生的角朊细胞逐渐向外周呈单层生长,在培养皿的周边部分细胞较致密.至接种后8~10d PK角朊细胞联接成片,铺满培养皿.而HPV NKC组细胞生长缓慢,培养初始接种数8×104 较为合适,12~15d才联接成片.两种细胞形态几无差别.
代写硕士论文
代写毕业论文
代写职称论文
Copyright @copy 2008-2015 代写毕业论文 代写硕士论文 版权所有

需要代写的客户请联系:QQ:4000290153 电话:18952021229