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HBsAg阳性孕妇血清中乙肝病毒前S/S基因的相似株现象

时间:2017-10-21 00:00:10 来源: 代写硕士论文

                     作者:李端,闫永平,徐德忠,张景霞 

【关键词】  肝炎病毒
  关键词: 肝炎病毒,乙型;前S/S基因;相似株;变异(遗传学) 
  摘 要:目的  探讨HBsAg阳性孕妇体内HBV病毒前S/S基因变异的状况. 方法  应用全长PCR技术从4例表面抗原阳性孕妇血清中扩增出HBV全长基因,将其克隆于pUC19载体,每例随机筛选5个阳性克隆,对其前S/S区进行序列分析. 结果  4例患者各克隆间均存在碱基的差异,此类患者体内HBV株同源性较差. 结论  HBsAg阳性孕妇体内HBV株呈“相似株”分布.
      
  Keywords:hepatitis B virus;preS/S gene;quasispecies;variation(genetics)
    
  Abstract:AIM To study the mutation of HBV preS/S gene in HBsAg carrying pregnant women.METHODS Full-length polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify whole HBV gene from sera of4HBsAg carrying pregnant women.The full-length PCR products were cloned into pUC19vector,5clones were obtained every woman and subgenomic PCR was used to amplify HBV preS/S gene for DNA sequencing.RESULTS Compared with the wild-type HBV C,all clones exhibited base insertion and substitution.CONCLUSION Quasispecies are the major characteristics in these HBsAg carrying pregnant women.
    
  0 引言
    
  随着分子生物学技术的发展,近年来人们发现许多HBV感染的患者个体内存在着不同的HBV基因株,即所谓的“相似株”现象(quasispecies)[1] ,证明他们的传播与临床肝炎的发病有着密切的关系,不同株的病毒复制水平、免疫原性和传播性等均不同.因此,对疾病的发展和转归的影响也不同[2] .
    目前,乙型肝炎病毒(HBV)的垂直传播是造成婴儿免疫耐受的重要原因,免疫耐受则是免疫预防失败的主要因素.研究表明,HBV基因在感染者体内的变异和不断演化是其重要原因之一
[3] .最近,对HBV基因变异与宫内传播关系的研究日益增多,但绝大多数研究采用PCR产物直接测序,分析一个片段序列,显然不能代表同时在体内存在的“相似株”;其次,研究样本小,难以检测HBV基因全序列,而部分序列是无法对出现在单个基因分子上的突变复杂性与致病和传播的关系得到精确和全面分析[4,5] .
    
  为清晰了解HBV基因在HBsAg阳性孕妇体内的变异状况,我们建立了乙型肝炎全长聚合酶链反应(Full-length PCR),从4例HBsAg阳性孕妇血清中扩增出HBV全长基因,并用标准的分子生物学方法克隆至pUC19载体,每例随机获得5个全长HBV克隆.在此基础上,对HBV前S/S区进行序列分析,发现HBsAg阳性孕妇体内的HBV前S/S基因具有异质性,即“相似株”现象.
     
  1 材料和方法 
  1.1 材料
     
  1.1.1 标本收集  
  4例HBsAg阳性孕妇血清收集自陕西省妇幼保健院产科,其中两例HBeAg亦阳性. 1.1.2 主要试剂和设备  大肠杆菌JM109为本室保存.pUC19购于华美生物公司.TaqDNA poly-merase,DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为美国Promega公司产品.Pwo DNA polymerase购自德国BMI公司.Sal I限制性内切酶和T4连接酶购自华美公司.蛋白酶K购自Merck公司.PE-480扩增仪购自美国PE公司.
  1.1.3 引物  
  分别合成了HBV全长PCR所用引物P1和P2[6] (划线处为Sal I酶切位点)及前S/S基因PCR扩增引物P3和P4[7] .引物由上海基康生物技术有限公司合成.
  1.2方法
     
  1.2.1 血清HBV DNA提取  
  200μL血清与蛋白酶K裂解液1∶1混合(终浓度为20mmol・L-1 Tris-HCl,pH8.0,10mmol・L -1 EDTA,100mL・L-1 SDS,0.8mg・mL-1 蛋白酶K).65℃4h,99℃15min,离心后取上清,常规酚/氯仿抽提2次,无水乙醇沉淀,750mL・L-1 乙醇洗涤干燥后,DNA溶于20μL双蒸水中.
     
  1.2.2 全长PCR扩增  
  自血清标本提取的DNA3μL,进行全长HBV DNA扩增,同时设置模板为HBV DNA阴性血清和模板提取时所用的无菌水的阴性对照.反应条件为50μL反应体积中加入引物P1,P2各300pmol・L-1 ,4×dNTP各0.2mmol・L-1 ,MgCl2 1.5mmol・L-1 ,1×反应缓冲液及Taq/Pwo混合DNA聚合酶2.6U.采用热启动聚合酶链反应8] ,先将45μL反应混合物加热至85℃,再加入5μL酶反应混合物.PCR于94℃45s,60℃1min,72℃4min(每循环自动增加延伸5s),40个循环后,于72℃延伸10min.溴乙锭琼脂糖凝胶电泳观察结果. 
  1.2.3 扩增产物的酶切及克隆  
  3.2kb扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收后,用Sal I酶切,同时酶切载体pUC19.酶切后电泳并从凝胶中回收片段,用T4连接酶连接过夜后,转化大肠杆菌JM109,37℃培养过夜,每例随机挑取5个白色菌落,提取质粒DNA并进行鉴定.
     
  1.2.4 前S/S基因PCR扩增及测序  
  以HBV DNA全基因质粒为模板,用引物P3和P4对前S/S基因进行扩增.扩增条件为94℃60s、55℃60s,72℃2min,共35个循环.扩增产物纯化后,用ABI PRISM377自动测序仪进行序列测定,测序由上海基康公司完成.
     
  1.2.5 序列的计算机分析  
  采用Megline及Vec- torNTI序列分析软件对所有克隆进行同源性、进化树等分析.
     
  2 结果
     
  2.1 前S/S基因的变异方式  
  通过计算机分析,发现所测20个克隆的核苷酸序列与基因库中所存入的22个HBV全序列中的HBV C基因型同源性最高,故以HBV C基因型为参照序列.与之相比,所有克隆中平均替代率为1.64%,缺失率为0.3%,插入率为0.9%,三种突变模式中替代最为明显(Tab1).表1 20个克隆与HBV野生株(C型)的前S/S区核苷酸序列比较的变异方式(略)
    
  2.2 HBV前S/S区各克隆株间核苷酸变异比较  
  通过计算机分析发现,每例患者的5个克隆间的核苷酸均发生了较大的变化,20个克隆中没有与野生株序列完全一致者.其中核苷酸的变异范围A为18~30个碱基、B为15~32个碱基、C为15~27个碱基、D为17~33个碱基,突变率范围分别是1.5%~2.5%,1.25%~2.67%,1.25%~2.25%,1.42%~2.75%(Tab2).表2 20个克隆与HBV野生株(C型)之间前S/S区核苷酸变异比较(略)
   
  2.3 HBsAg阳性孕妇4例前S/S基因的种系进化树  
  对20条前S/S序列用计算机软件绘制出种系进化树.从Fig1可以看出4个HBsAg阳性孕妇体内20个克隆的进化距离不一致,但各患者有自己的进化距离范围.说明HBsAg阳性孕妇体内前S/S基因区呈高度异质性,又有各自的遗传协同性,很可能是各从一支HBV野生株感染后在体内变异,进化成一群“相似株”.

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