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博莱霉素损伤早期EGF,TGF┐β1 活性表达与肺泡泡炎病理分级

时间:2017-10-20 15:00:09 来源: 代写硕士论文

                     作者:王玮 魏经国 魏龙晓 崔光彬 陆洲 张伟 李琦 

【关键词】  肺纤维化
  关键词: 肺纤维化;表皮生长因子-尿抑胃素;转化生成因子-β;病理学
     
  摘 要:目的  定量测量小鼠肺泡炎肺泡灌洗液中EGF,TGF-β1 的表达与同期肺泡炎的病理分级和肺泡Ⅱ型细胞超微结构的变化间的关系. 方法  通过气管内滴注博莱霉素A5建立小鼠肺泡炎模型,按采集灌洗液的时间(1,3,7d)分为3组,分批直视下取肺泡灌洗液,采用夹心ELISA法定量检测灌洗液中EGF,TGF-β1 表达,同时取各组的肺组织行常规HE染色,光镜观察肺泡的病理变化及炎症分级,电镜观察肺泡Ⅱ型细胞的超微结构变化.结果实验组ELISA测定显示:1,3,7d组肺泡灌洗液中EGF的水平均低于正常对照组(P<0.01),TGF-β1 的水平有所升高,但与正常对照组比较无显著性差异.病理学检查显示,各组病变以Ⅰ级肺泡炎为主,随病程进展逐渐向Ⅱ,Ⅲ级发展,肺泡Ⅱ型细胞变性坏死以3,7d组明显.将EGF和TGF-β1 的水平与肺泡炎的分级对照相比较,各组EGF水平变化与肺泡炎分级相关不显著,但r值均为负值.TGF-β1 水平升高与肺泡炎分级呈显著正相关(P<0.01). 结论  博莱霉素损伤早期肺泡Ⅱ型细胞变性、坏死,抑制了EGF自分泌的机制,诱导TGF-β1 活性高表达是肺间质纤维化进程启动的重要因素之一.
      
  Keywords:pulmonary fibrosis;epidermal growth factor-uro-gastrone;transforming growth factor beta;pathology
    
  Abstract:AIM Quantitative measurement of EGF,TGF-β1 in the alveolar lavage from pulmonary alveolitis(PAL)of the mouse mAel and comparative analysis of pathological grading of simultaneous pulmonary alveolitis with the ultrastructure changes of alveolar type II cell.METHODS PAL mouse mAels were established by single intratracheal injection of bleomycin A5(BLM A5 ).After1,3,7d,mouse mAels were operated on according to the divided groups and BAL was obtained.EGF and TGF-β1 quantitative expression of BAL was studied by adopting ELISA methA.The pulmonary tissues were obtained and the pathological change was demonstrated under routine microscope and the ultrastructure changes of alveolar type II cell were observed through an electronic microscope.RESULTS ELISA measurement of the experimental groups showed that EGF expressions of BAL of1,3and7d groups were lower than those of normal groups(P<0.01),but the TGF-β1 expressions increased while they did not make any distinct difference in contrast with the normal groups.Pathological examination discovered that the I-rate PAL took a dominant position and with the de-velopment of the course it worsened into theⅡandⅢ-rate PAL gradually.The electronic microscope check-up showed that the alveolar typeⅡcell in the experimental groups end-ed up in both degeneration and necrosis with the most strik-ing distinction in3,7d groups.The comparative analysis of EGF and TGF-β1 expression with the grading of PAL showed that the changes of EGF expression in each group were not clearly related with the grading of PAL,but r-value proved negative.The increase of TGF-β1 expression had close associ-ation with the grading of PAL(P<0.01).CONCLUSION Degeneration and necrosis of the alveolar typeⅡcell of pul-monary alveolitis in early Bleomycin-induced pulmonary in-juries may inhibit the autocrine of EGF while they induce the active high expression of TGF-β1 ,which might be one of the major factors in the initiation of pulmonary interstitial fibro-sis. 
  0 引言 
     
  博莱霉素A5 (BLM A5 )复制的小鼠肺间质纤维化动物模型与人类的病变类似[1] ,已广泛应用于该病的研究.近年研究显示,在肺间质纤维化形成过程中,某些细胞因子可能起重要作用.其中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1 ,TGF-β1 )是人们关注的热点[2,3] .但这两种细胞因子与肺泡炎病理变化的对照研究以及肺泡Ⅱ型上皮细胞的形态学变化间的关系国内外未见相关报道.本研究采用BLM A5 气管内滴注所致小鼠肺间质纤维化模型,对肺泡灌洗液中这两种细胞因子进行分析并与同期实验组小鼠肺组织的病理改变进行对照研究.
     
  1 材料和方法
     
  1.1 材料  TGF-β1 ,EGF,ELISA试剂盒购自深圳晶美工程有限公司,选用96T,TGF-β1 ,批号:011027G EGF批号:011112A BLM A5 :日本株式会社生产,15mg/支,批号:910608.实验动物:本校实验动物中心提供健康雄性昆明小鼠51只,体质量80~100g. 
  1.2 方法
     
  1.2.1 肺纤维化动物模型制备  雄性昆明小鼠51只,分1,3及7d3组,每组17只,每组模型制作12只,正常对照5只.BLM A5 气管插管给药,用量为2.5mg・kg-1 ,用9g・L-1 生理盐水配成4g・L-1 的溶液,采用氯胺酮ip麻醉,用量为0.3mL・kg-1 .采用细聚乙烯塑料管与注射器相连,BLMA5药液预先装在注射器内,插管达气管分叉处,缓缓注入BLM A5 .注完药后将动物直立、旋转,使药液在肺内均匀分布.数分钟后,动物恢复常态,正常进食饮水.实验组模型复制成功各组8只,共24只.
     
  1.2.2 肺泡灌洗液采集  于注药后1,3,7d各组动物在氯胺酮腹腔注射麻醉后,开胸直视下行肺泡灌洗.灌洗液为9mL・L-1 生理盐水,每次用量约0.3mL,共灌洗3次.第1次弃之,混合第2、3次灌洗液共约0.4mL,用于ELISA分析.取左肺组织40g・L-1 甲醛溶液内浸泡固定后,经石蜡包埋、5μm切片,HE染色,备以光镜病理学检查.取右肺切取1mm3 大小的组织块投入预先配制好的前固定液中(前固定液①10mg・ml-1 钌红;②0.3mol・L-1 二甲胂酸钠缓冲液;③180mL・L-1 戊二酸;④180mL・L-1 单宁酸.使用前按2∶2∶1∶1比例配制)密封后置4℃冰箱中固定12h.然后用0.1mol・L-1 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次共30min后,置于配制好的后固定液中(后固定液:50mL・L-1 锇酸和前固定液中的①、②液按1∶1∶1配制).固定15min后逐级用丙酮脱水、环氧丙烷媒浸、环氧树脂包埋、薄片定位,切成超薄片,醋酸钠和椽酸铅染色,JEM-2000EX型透射电镜观察.
     
  1.2.3 TGF-β1,EGF含量测定  采用双抗体夹心ELISA法,抗人TGF-β1 和EGF(同源性TGF-β1  98%,EGF70%)单抗被包被于酶标板上,灌洗液中和标准品中经活化的TGF-β1 和EGF与各自单抗结合,未结合物将被洗去,加入辣根过氧化物酶标记的抗人TGF-β1 ,EGF,与结合在单抗上的TGF-β1 ,EGF结合而形成免疫复合物,洗去复合抗体,加入显色剂,若反应孔中有上述两种细胞因子,将有蓝色出现,加终止液变黄.在450nm处测A值,细胞因子浓度与A450nm 值之间呈正比,通过绘制标准曲线求出标本液中TGF-β1 和EGF浓度.
     
  1.2.4 组织病理观察  光镜观察,参照Szapiel等[4] 的方法确定肺泡炎的程度,将肺泡炎分为4级:(0)无肺泡炎;(1)轻度肺泡炎(Ⅰ级)表现为单核细胞浸润使肺泡膈增宽,仅限于局部和近胸膜部,面积小于全肺的20%,肺泡结构正常;(2)中度肺泡炎(Ⅱ级),受累面积占全肺的20%~50%,近胸膜部较重;(3)重度肺泡炎(Ⅲ级),面积大于50%,偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成的实变.电镜观察:肺泡上皮基底膜的完整性;肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构.重点观察胞质内板层小体的数量与形态,同时观察线粒体、高尔基体及粗面内质网的结构变化.
     
  2 结果
     
  2.1 各组肺泡灌洗液细胞因子浓度
     
  2.1.1 肺泡灌洗液EGF浓度  肺泡灌洗液EGF浓度ELISA测定结显示,1,3,7d实验组肺泡灌洗液中EGF含量平均值显著均低于同期对照组(P<0.05或P<0.01),且随病程延长有下降趋势,1d和3d实验组EGF A值间t=2.083,P<0.05.1d和7d实验组EGF A值间t=3,P<0.01.对照组肺泡灌洗液中EGF浓度无明显变化(Fig1).
     
  图1 略
     
  2.1.2 肺泡灌洗液中TGF-β1 浓度  肺泡灌洗液中TGF-β1 浓度ELISA测定结果显示,7d实验组与对照组TGF-β1 浓度近似,1d及3d实验组TGF-β1 浓度均稍高于对照组,但实验组TGF-β1 水平有下降趋势.各对照组肺泡灌洗液TGF-β1 水平无明显变化.
     
  图2 略
     
  2.1.3 各组EGF,TGF-β1 阳性率  实验组1,3,7d各组均为8只小鼠,因7d组一只小鼠取材时肺出血严重故未做肺泡灌洗,因此该组实际纳入统计动物为7只共计23只小鼠.Tab2实验组与之相同.
    
  Tab1结果:实验组中EGF阳性率为21%,正常组66%,两组χ2 检验P<0.01,差异有高度显著性.
    
  显示实验组TGF-β1 阳性率为43%,对照组TGF-β1阳性率为25%,实验组高于对照组.两组率的χ2 检验,无显著性差异.
     
  表1 各组EGF,TGF-β1 阳性率统计表 略
         
  2.1.4 各组实验动物肺泡炎组织病理学分级结果  光镜观察结果,各对照组小鼠均未见肺泡炎病理表现,实验组肺泡炎分组结果:1d组Ⅰ级6只,Ⅱ级2只,无Ⅲ级.3d组Ⅰ级4只,Ⅱ级2只,Ⅲ级2只.7d组Ⅰ级2只,Ⅱ级3只,Ⅲ级2只(Fig3~5).
    电镜观察结果,肺泡上皮基底膜水肿、裸露甚至断裂.Ⅱ型肺泡细胞变性、坏死,部分细胞崩解,线粒体结构破坏,板层小体数量减少,以3,7d组变化明显.7d组可见新生毛细血管分布于基底膜的纤维化区(Fig6). 

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