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茶多酚诱导膀胱癌T24细胞株凋亡及上调PTEN表达

时间:2017-07-23 12:00:04 来源: 代写硕士论文

【摘要】  目的 探讨茶多酚抑制膀胱癌细胞生长的可能分子机制。 方法 采用MTT法和流式细胞术,观察膀胱癌细胞系T24 经不同浓度的茶多酚处理后对细胞生长以及PTEN蛋白表达的影响。 结果 茶多酚以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞的生长,加入0、50、100、200、400μg/ml茶多酚的T24 细胞抑制率分别为0%、11.2%、33.4%、36.9%、67.5%。流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰,癌细胞出现凋亡,凋亡率分别为6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%;同时,随茶多酚作用浓度的增加,出现G1/S阻滞细胞逐渐增多,细胞分裂增殖指数(PI) 降低;而细胞PTEN 蛋白表达水平由(37.66±0.49)逐渐增加至(163.92±3.36)(P< 0.01)。 结论 茶多酚对T24细胞生长具有抑制作用,其机制可能是通过上调PTEN 蛋白表达影响细胞周期和诱导细胞凋亡。PTEN蛋白表达水平的上调可能具有逆转细胞恶性生物学行为作用。

【关键词】  茶多酚 膀胱癌 凋亡 PTEN 蛋白

  【Abstract】  Objective  To explore the molecular mechanism of inhibition effect of tea polyphenols on the growth of bladder carcinoma cell lines.  Methods  MTT assay and flow cytometry(FCM) analysis were applied to investigate the effects of TP on the cellular growth, proliferation cycle, apoptosis, and the expression of PTEN in bladder carcinoma cell lines. Results  To inhibited the growth and inducted apoptosis of T24 cells in a dose-dependent manner, under the dosages of 0μg?ml?1、50μg?ml?1、100μg?ml?1、200μg?ml?1 and 400μg?ml?1 average inhibitory rate were 0%、11.2%、33.4%、36.9% and 67.5%, and hypodiploid peaks on FCM histogram. Apoptosis rate were 6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%;Moreover, the cell cycle could be arrested at G1/S checkpoint, also made G1 phase cell markedly increasing and the cell proliferating index (Pl) also decreased. At the same time, the expression of PTEN increased from 37.66 ±0.49 to 163.92 ±3.36(P<0.01) with TP treatment. Conclusion  TP has the inhibitory effects on the cellular growth, and the mechanism may be associated with influence in the cell cycle and induction of apoptosis in T24 cell lines. The cell cycle and apoptosis are associated with TP-induced increase of  PTEN protein level in the tumor cell lines. At the same time, the up-regulation of the PTEN 's expression by TP also has a possible reversing effects on malignant tumor cells .

  【Key Words】  Tea polyphenols  Carcinoma of bladder  Apoptosis  PTEN    

  茶多酚(TP) 是茶叶中最具有抗肿瘤活性的酚类及其衍生物为主的酚类化合物。研究发现,茶及茶多酚能抑制膀胱癌发生和进展[1,2]。作者于2005年9月至2006年5月用TP作用体外培养的膀胱癌T24细胞株,观察TP对膀胱癌T24细胞株生长及其PTEN蛋白表达水平的影响,探讨TP抑制肿瘤细胞株生长的可能分子机制。

  1  材料与方法

  1.1  膀胱癌细胞株T24的培养  膀胱移行上皮癌细胞T24株购于中国科学院上海细胞生化研究所,于含10%小牛血清的RPMI1640 (Sigma, USA)培养液中37℃、5%CO2培养。

  1.2  MTT法观察  用含10 %小牛血清的RPMI1640培养液,分别将2 种对数生长期的膀胱癌细胞调配成5×104/ ml的单细胞悬液,接种于96孔板(0.2ml/孔) 。设空白阴性对照及不同浓度(50、100、200、400μg/ml) 的TP组(中国茶叶研究所),各设5个平行孔,培养48h,实验终止前4h加入MTT(Sigma,USA) 液(5mg/ml) 10μl/孔,反应完毕弃上清液加入DMSO 100μl/孔溶解沉淀,轻轻振动后用波长570 nm 的酶联仪测定各孔的OD值,求出生长抑制率IR=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。上述所有实验均重复3次。

  1.3  流式细胞仪测定(FCM)  取对数生长期的膀胱癌细胞,取1×106/ml细胞接种到96孔培养板(0.2ml/孔) ,每组3孔。加入不同浓度的TP,并各设2个平行组为TP组;另外,加入等体积生理盐水的RPMI1640细胞培养液设为对照组。培养48h后,以0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA)消化,制成细胞悬液,TP组和对照组分别进行下列检测:(1) PBS洗涤2次,加入10mg/L  RNaseA 200μl,水浴30min,碘化丙啶染色30min,4℃避光。FCM(BD,USA)检测细胞周期,并计算细胞分裂增殖指数(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100%。(2)平行组和对照组分别加入鼠抗人PTEN(MBI,USA) 20μl,PBS 洗涤5min×3次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG(Zymed,USA) ,37℃孵育30min,PBS冲洗5 min×3次。对照组1:40稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体20μl。4℃孵育30 min后,FCM检测膀胱癌细胞PTEN的表达,并以荧光强度的几何均数表示。(3) 平等组和对照组分别Celleguest 软件分析FLA直方图获取的阳性标记细胞的凋亡率(APO)。上述所有实验均重复3次。

  1.4  统计学处理  结果以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 10.0软件中的组间采用t检验。

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