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黄褐毛忍冬总皂苷对卵清蛋白致敏小鼠的抗过敏作用

时间:2017-07-08 06:00:11 来源: 代写硕士论文

【摘要】  目的: 观察黄褐毛忍冬总皂苷(Ful)对卵清蛋白(OVA)致敏小鼠的抗过敏作用,为临床用于治疗食物过敏提供药理学依据. 方法: 建立BALB/c小鼠食物过敏模型,设过敏反应组(Se),Ful高(H)、中(M)、低(L)浓度组及生理盐水对照组(NS). ELISA测定血清中OVA特异性IgE水平、小肠黏液中总IgA及OVA特异性IgA水平;甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞,HE染色观察空肠形态;足垫肿胀实验检测迟发型超敏反应. 结果: OVA隔日激发3~4次后,Se,L,M组均有3/4以上小鼠出现急性腹泻. 高浓度Ful可抑制过敏小鼠腹泻发生,减轻肥大细胞聚集和脱颗粒,降低OVA特异性IgE水平,缓解OVA介导的足垫肿胀反应,减轻小肠绒毛炎症. 结论: 高浓度Ful可同时缓解食物过敏小鼠IgE介导的及细胞介导的超敏反应.

【关键词】  黄褐毛忍冬总皂苷 食物过敏 卵清蛋白

 0引言

  食物过敏是儿童期常见的变态反应性疾病,患病率逐年上升,严重影响了儿童尤其是婴幼儿的生活质量. 目前,对食物过敏治疗的研究包括免疫疗法、益生菌疗法及基因疗法[1]等. 此外,传统中药以其价廉、有效、副作用小等优点,作为抗过敏治疗的补充和替代亦受到重视. 我们前期研究已证实,单味金银花(黄褐毛忍冬)水提物对卵清蛋白(ovalbulmin, OVA)导致的速发型和迟发型变态反应均有缓解作用[2],现进一步选用黄褐毛忍冬总皂苷(fulvotomentoside, Ful)作用于OVA致敏小鼠,观察其抗过敏作用.

  1材料和方法

  1.1材料OVA(Sigma, USA);氢氧化铝凝胶(Sigma, USA);大鼠抗小鼠IgA(Biolegend, USA);辣根过氧化酶(HRP)标记的大鼠抗小鼠IgE及羊抗小鼠IgA(Southern Biotechnology Associates, USA).

  1.2方法

  1.2.1黄褐毛忍冬总皂苷分离提取药材来源于贵州黔西南州种植基地,部位为黄褐毛忍冬干燥花蕾. 系贵州中医药研究院以大孔树脂工艺提取,样品中Ful含量为66.11%.

  1.2.2建立动物模型及分组重庆医科大学实验动物中心提供的BALB/c小鼠连续传两代,以第3代雌鼠(6 wk龄)作为实验对象. 40只小鼠随机分为5组,每组8只. 取其中4组建立食物过敏模型,分为过敏反应组(Sensitization group, Se)以及Ful高(200 mg/kg, H)、中(100 mg/kg, M)、低(50 mg/kg, L)浓度组;另设生理盐水对照组(NS). ①基础致敏和强化致敏:Se及H,M,L组第1日用含10 μg OVA(V级)及1 mg氢氧化铝凝胶的生理盐水0.5 mL腹腔注射腹腔注射.进行基础致敏,第15日用只含10 μg OVA(V级)的生理盐水0.5 mL腹腔注射.强化致敏,NS组腹腔注射等量生理盐水. ②激发肠道过敏反应:第20日起以OVA(Ⅱ级)生理盐水溶液0.4 mL(OVA浓度250 g/L)对Se及H,M,L组进行隔日灌胃激发直至第42日,NS组同时以等量生理盐水灌胃. ③给药:第20日起给H,M,L组依不同的体质量皮下注射相应浓度的Ful,0.01 mL/g,1次/d×22d. Se及NS组皮下注射等量生理盐水.

  1.2.3血清OVA特异性IgE水平检测采用ELISA法,以每孔100 μL OVA(浓度10 mg/L)包板,血清样品按原浓度加样. 结合反应时HRP标记的大鼠抗小鼠IgE二抗稀释浓度为1∶1000, TMB显色后终止反应,全自动酶标仪测定A450 nm值.

  1.2.4小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平检测肠黏液采集和处理参照文献[3],采用ELISA法. OVA特异性IgA检测时OVA包被浓度为10 mg/L,总IgA检测时大鼠抗小鼠IgA按1∶1000稀释后包被,小肠黏液均按1∶25稀释,结合反应中二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgA,以1∶1000稀释.

  1.2.5形态学观察HE染色观察空肠形态;甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞. 随机连续计数空肠10个高倍视野内肥大细胞数,取平均值代表其密度. 累计肠系膜10个高倍视野内肥大细胞总数及脱颗粒肥大细胞数,计算完整肥大细胞百分率. 完整肥大细胞百分率=[(肥大细胞总数-脱颗粒肥大细胞数)/肥大细胞总数]×100%.

  1.2.6迟发型超敏反应(DTH)检测第40日时进行足垫肿胀实验. 用游标卡尺测量小鼠后足垫厚度,之后足垫注射0.05 mL OVA(浓度2 g/L)溶液. 48 h后再次测量同一部位,以两次测量差值作为评价OVA特异性DTH的指标.

  统计学处理:采用SPSS11.0统计软件. 各组数据进行方差齐性检验提示方差齐同,结果以x±s表示,用SNK法(q检验)在各组间做两两比较,P<0.05为差异有统计学意义.

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