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非清髓性骨髓移植诱导同种异基因心脏移植长期免疫耐受的实验研究

时间:2017-07-06 15:00:07 来源: 代写硕士论文

【摘要】  目的比较多种不同的预处理方案,筛选一种具有低毒性、能诱导出长期稳定的同种异基因移植免疫耐受的非清髓性预处理方案。方法受体BALB/C(H?2d)小白鼠,供体C57BL/6(H?2b)黑小鼠,建立小鼠耳后心脏移植模型。在心脏移植(HT)前,给予受体腹膜腔内注射抗胸腺细胞血清(ATS)5次、亚致死剂量全身X线照射(TBI)1次、骨髓移植(BMT)等7个不同组合的预处理方案,术后观察移植心脏跳动情况,于骨髓移植后第28 d检测外周血中嵌合体。

结果一实验组(ATS+TBI450 cGy +BMT+HT)采用受体在心脏移植前接受5次腹膜腔内注射ATS、1次TBI(450 cGy)、静注供者骨髓细胞5×107个等处理的非清髓性治疗方案,移植心脏(9/10)存活>100 d;骨髓移植术后第28 d检测外周血,均出现完全异体细胞嵌合状态。结论早期应用ATS与亚致死量TBI有着协同作用;非清髓性预处理方案(ATS+亚致死量TBI(450 cGy)+BMT)既获得了持久、稳定的供者造血干细胞嵌合体,也诱导出同种异基因移植长期特异性免疫耐受。

【关键词】  骨髓移植 心脏移植 基因 移植 同种 合体 免疫耐受

    诱导移植免疫耐受是近年来器官移植领域的焦点课题。国外实验证明了造血干细胞嵌合体能够诱导长期、稳定的供者特异性免疫耐受,是目前最有可能应用于临床的免疫耐受诱导方法[1?2]。为探讨一套能够成功地指导临床建立稳定、持久移植耐受的治疗方案,本研究选用成功率高、重复性好、指标客观、稳定的小鼠耳后同种心脏移植模型,通过比较多种不同的预处理方案,旨在筛选出一种具有低毒性、切合临床实际、能诱导出长期稳定的供者特异性移植耐受等优点的围术期预处理方案,为临床应用提供一些理论与实验依据。

    1动物与方法

    1.1动物7~9周龄雄性BALB/C(H?2d)小鼠作为骨髓移植受者,7~9周龄雄性C57BL/6(H?2b)小鼠作为供者。供、受者体质量20~30 g。出生≤24 h C57BL/6幼鼠作为心脏移植供者。实验动物由福建医科大学动物中心提供[动物合格证号SCXK(沪)2003?0003]。

    1.2方法

    1.2.1全身X线照射(TBI)按治疗方案所定时间、剂量给受者BALB/C小鼠进行单剂量TBI。X光机(Philips电器公司,Rahway, NJ)200 kV,10 mA,速率84 cGy/min,0.5 mm铜过滤器。

    1.2.2抗胸腺细胞血清(ATS)注射ATS购自 Accurate Chemical & Scientific Corporation (NY,USA)。购回后即用BALB/C小鼠红细胞进行脱毒(去掉变应原)处理,分装后置-20 ℃冷藏备用。每只小鼠1次剂量ATS 0.05 mL+生理盐水0.5 mL,腹膜腔内注射。

    1.2.3骨髓细胞悬液制备无菌条件下,取供者双侧股骨与胫骨,给予2%胎牛血清PBS溶液冲洗骨髓腔,经60目尼龙网过滤,制备单细胞悬液,调整浓度为1×108 mL-1备用。

    1.2.4骨髓细胞移植(bone marrow transplantation,BMT)经尾静脉给予每只受者注射0.5 mL悬液(含有核骨髓细胞5×107个)。

    1.2.5小鼠耳后心脏移植将C57BL/6幼鼠置于冰中,2~3 min无菌切开胸骨,取出整个心脏,置于4 ℃生理盐水中,随后将供心移植在受者耳廓皮下。术后第5 d起,在10倍放大镜下观察移植心脏跳动情况。如术后10~12 d仍未出现心脏跳动,则为手术失败,不列入实验结果。以心脏跳动完全停止日定为排斥时间,并隔日进行复查,连续3次结果一致,则确认为排斥反应,并取下移植心脏送病理检查。

    1.2.6嵌合体检测主要试剂:抗小鼠单克隆抗体荧光标志物为anti?CD16/CD32(FcrIII/II),anti?H?2Kb?FITC,anti?H?2Kd?FITC,anti?TCRβ?PE,anti?Gr?1?PE,anti?Mac?1?PE,anti?B220?PE(美国Pharmingen公司)。

    在骨髓移植后第28 d采受者眼球后全血,分别

    进行T细胞、粒细胞/巨噬细胞、B细胞单克隆抗体荧光染色。所有标本均使用FAC Scan流式细胞仪(Becton Dickinson,MV,CA)检测与分析。

    1.2.7组织形态学随机抽取部分被排斥的与长期存活(>100 d)的移植心脏标本,做组织切片及H?E 染色,以验证病理形态学改变与实验观察结果的一致性。

    1.3实验分组?预处理治疗方案组所有受者除了进行如下各方案治疗外,不用其他任何免疫抑制剂;所有供者均未作任何特殊治疗。一次性TBI照射,剂量800 cGy 或450 cGy;ATS 为隔天腹膜腔内注射1次,共5次;每只骨髓移植(BMT)细胞数5×107/0.5 mL。分7个治疗方案进行研究:

    (1)TBI(800)+BMT+HT

    Day-1????Day0?????Day28

    TBI(800 cGy)BMT,HT检测嵌合状态

    (2)TBI(450)+BMT+HT

    Day-1?????Day0?????Day28

    TBI(450 cGy)BMT,HT检测嵌合状态

    (3)ATS+TBI(450)+BMT+HT

    Day -12,-10,-8,-6,-4??Day -1??Day0??Day28

    注射ATS(共5次)TBI(450 cGy)BMT,HT检测嵌合状态

    (4)ATS+HT

    Day -12,-10,-8,-6,-4??Day 0

    注射ATS(共5次)HT

    (5)ATS+BMT+HT

    Day -12,-10,-8,-6,-4?? Day0???Day28

    注射ATS(共5次)BMT,HT检测嵌合状态

    (6)TBI(450)+HT

    Day-1?????Day0

    TBI(450 cGy)HT

    (7)ATS+TBI(450)+HT

    Day -12,-10,-8,-6,-4???Day -1???Day0

    注射ATS(共5次)TBI(450 cGy)HT

    1.4统计学处理实验数据以实际数据与x±s表

    示。多组间比较采用方差分析,两两比较采用Student?Newman?Keuls 检验。

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