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移植受者免疫抑制治疗影响外周血微量CMV DNA的变化

时间:2017-07-05 12:00:08 来源: 代写硕士论文

【摘要】  目的:探讨移植术后免疫抑制治疗个体,外周血中巨细胞病毒脱氧核糖核酸(CMV DNA)的变化规律,并评价其潜在的临床应用价值。方法:通过对免疫抑制治疗个体、健康个体外周血微量CMV DNA的检测,分析CMV DNA与免疫抑制剂浓度的关系;同时对30例患者的连续标本进行配对实验,说明过度免疫抑制可导致微量CMV DNA的出现。结果:健康个体组、环孢素组、FK506组中微量CMV DNA阳性率分别达到0%、42.24%和11.8%,阳性组平均免疫抑制药物浓度明显高于阴性组(P<0.05),高药物浓度组阳性率明显高于低浓度组(P<0.05)。配对实验提供了相同的结果。结论:免疫抑制药物浓度影响微量CMV DNA动态的变化,部分反映了个体免疫抑制状态,对指导临床用药有一定的价值。

【关键词】  移植 免疫抑制 巨细胞病毒

    Abstract:  Objective:To investigate approved immunosupression concentration whether influence trace CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells of the posttransplantion. Methods: 294 cases of  patients (410 cases of blood sample) of post-transplantation and 96 cases samples of health check up were collected continuously in 2 months. Immunosuppression concentration and CMV DNA were measured with TDx,IMX and nested PCR respectively. Immunosuppression concentration of patients whose samples were continuously detected CMV DNA positive and negative were analyzed by paired samples test. Result: CMV DNA was detected in 42.24% and 11.8% in CSA or FK506 treated patients but not in all 96 health check up individuals. As CSA concentration up to 200ng/ml, patients had highest CMV DNA positive rate 55.71% (P<0.05). The mean CSA and FK506 concentrations of CMV DNA positive group were higher than that of CMV DNA negative group (P<0.05);paired samples test get the more significant result (P<0.05). Conclusion: Nested PCR detected CMV DNA maybe an assay for indirectly evaluated immunosupression state of the posttransplantation.

    Key words:   transplantation;immunosuppression;CMV

    排斥或感染一直是移植受者服用免疫抑制药物必须面临的两大问题。而解决此矛盾的首要措施即是寻找一个能综合反映个体免疫状态的指标,建立评价个体免疫抑制状态的有效技术。国人抗CMV IgG阳性率接近100%,世界范围内亦有60%~100%的感染率。根据CMV的潜伏感染特点,尝试以外周血微量CMV DNA作为评价免疫抑制状态的指标,采用敏感的巢式聚合酶链反应(nPCR)技术检测移植受者外周血中微量CMV DNA,并探讨其与免疫抑制程度的关系。

    1  材料和方法

    1.1  免疫抑制药物浓度检测  受者的免疫抑制方案均以环孢素(CSA)或他克莫司(FK506)为主。服药前,抽取静脉血测全血CSA或FK506浓度谷值。CSA、FK506浓度分别采用酶免疫发光技术(仪器Abbott TDx)和微粒子酶免疫分析技术(仪器Abbott IMx)测定。

    1.2  标本及分组  采用酶联免疫吸附试验检测受者及96例健康体检人员的血浆CMV IgG抗体,并检测CMV DNA。连续收集2006年10月至2006年12月移植随访者药物浓度检测血标本,共294例受者,410例次。移植随访者均为移植术后3个月以上。其中服用CSA为173人,服用FK506为121人;男180例,女114例,平均年龄(44.39±11.97)岁。根据免疫药物浓度(CSA以200 ng/ml或120 ng/ml为界线;而FK506浓度以5 ng/ml为界线)将其分组。另根据CMV DNA检测结果将其分为阳性组和阴性组。其中46例多次检测,当同一个体先后出现CMV DNA阳性和阴性时对其药物浓度进行配对比较(此两标本为连续收集的标本)。移植患者术前行常规CMV DNA检查,结果均提示阴性。移植患者术后第3周开始予更昔络维针250 mg/d预防病毒感染治疗,疗程1周。

    1.3  DNA提取  收集环孢素浓度测定标本,取300μl全血加入0.98%的NH4Cl 1ml破红细胞膜10 min,离心后取白细胞加入300μl细胞裂解液,充分混匀后放置10 min;加入蛋白质沉淀液150μl充分混匀,离心5 min(12 000 r/min);取上清液加入异丙醇300μl沉淀蛋白质;以75%乙醇洗3次,待乙醇蒸发后加入溶解液100μl,-20 ℃保存。

    1.4  核酸扩增  ① nPCR:根据CMV病毒基因组设计引物,第一次PCR扩增引物分别为P1 5'-TCTAAGAC ATAGCAGCACAGCACC-3'和P2 5'-TGAAAAAATATACCCAGAC GGAAG-3';第二次PCR扩增引物分别为P3 5'-AGCAC CCGACAGAACTCACT-3'和P4 5'-TATGGCTTATGCCCAGAAAA-3'。取1μl DNA用于10μl的 PCR体系,其中包括:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTP、0.45 U Taq polymerase、0.1μM引物和5%甘油。第一次PCR条件为94 ℃ 2 min后,进行30个循环,94 ℃ 20 s,58 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s;最后进行72 ℃ 2 min延伸。完成后取1μl PCR产物用于第二次扩增,94 ℃ 2 min后,进行25个循环,94 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s;最后进行72 ℃ 2 min延伸。经2%的琼脂糖电泳,紫外分析仪上观察结果。标本分别检测3次,出现一次阳性便判断为阳性。②常规PCR:反应条件同上,循环次数增加到35次,引物分别采用P3、P4。

    1.5  临床观察  对所有具CMV发病症状的受者进行常规pp65检测。通过核对pp65记录,回顾性分析CMV DNA阳性受者是否出现CMV发病的典型症状。

    1.6  统计学处理方法  对CMV DNA阳性、阴性两组环孢素、FK506浓度进行student T test分析。采用卡方检验分析不同免疫抑制药物浓度组CMV DNA阳性率的差别。配对两组进行非参数Mann Whitney检验。

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