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聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递

时间:2017-07-04 18:00:04 来源: 代写硕士论文

【摘要】  【目的】 研究非病毒基因载体聚乙二醇(PEG)-聚乙烯亚胺(PEI)共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】 将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用,测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位,及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】 PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力;连接PEG 5 000 能够明显降低复合物的粒径;复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低;细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化,而是取决于PEG的接枝量;共聚物PEG-PEI(2-25-1)被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】 共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。

【关键词】  PEG-PEI共聚物; 非病毒基因载体; 基因转染

    基因治疗是将外源性基因导入靶细胞内有效表达,从而使得在基因水平治疗一些顽疾成为可能。将外源性基因导入体内必须借助于一个安全、稳定、转染率高的载体。目前,基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。体内基因治疗80%采用病毒载体系统作为基因传输载体, 例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等,非病毒载体包括脂质体和阳离子聚合物。病毒载体与非病毒载体相比转染率高,但存在着一些安全隐患,如对特异的细胞有限制性靶向性,DNA装载量有限,潜在的病毒重组和成本较高等问题使得它的实际应用受到限制[1]。非病毒载体如阳离子脂质体和阳离子共聚物可克服目前病毒载体在安全性、免疫原性和价格方面等问题[2]。在目前应用的非病毒载体中,多聚阳离子共聚物聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI),在体内外都表现出高的转染率[3]。  PEI的重复结构单体中每两个碳原子就连接含氮原子的伯胺和仲胺,支链型的PEI还包括叔胺,都可质子化生成正电性氨基,成为与DNA上带负电荷的磷酸根结合的作用点,形成纳米级的聚合物/DNA复合物,可被细胞摄取。另一方面,大量的阳离子电荷产生较大的毒性,限制了阳离子共聚物的体内应用。因此,许多学者研究将阳离子共聚物连接上非离子的亲水性基团,如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)[4], 聚[N-(2-羟丙基)异丁烯酰胺] [5]。这些亲水性的共聚物可提高复合物的溶解性,减少聚集,减少生理环境下与蛋白的非特异性相互作用 [6]。本文采用异佛尔酮二异氰酸酯(isoporon diisocyanate, IPDI)作为偶联剂制备了含不同PEG分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物。考察了聚合物/DNA复合物的粒径和zeta电位,还考察了转染率与PEG-PEI共聚物的毒性和结构的关系。研究PEG链长与接枝量对基因传递过程的影响和规律。

    1   材料和方法

    1.1   试剂 

    聚乙烯亚胺(PEI,MW25000, Aldrich-Sigma公司产品,支链型,无水);聚乙二醇单甲醚(mPEG, MW 为2000和5000 ,Fluka公司); IPDI(广州市汇采涂料化学品有限公司,进口分装);二月桂酸二丁基锡(dibutyltin dilaurate, DBTL,广东丽宝涂料助剂公司)。

    1.2   细胞系

    人宫颈癌细胞系 Hela细胞(ATCC No.CCL-2.1),在100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中培养。血清56 ℃灭活30 min。

    1.3   质粒

    真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, pEGFP-C1),由华西医科大学惠赠,由CMV启动子驱动,在DH5α菌株中大量扩增。由QIAGEN公司的质粒大抽提试剂及纯化柱制备质粒,酶切鉴定。

    1.4   异氰酸酯单端基聚乙二醇(PEG-NCO)的制备  

    定量的mPEG溶于无水氯仿中,加入过量的IPDI,溶于氯仿,再加入0.6%~0.7%的催化剂DBTL。将上述两溶液混合, 75 ℃左右回流反应8 h,所得产物在石油醚中沉淀,沉淀用氯仿溶解,再用石油醚沉淀,此操作重复多次直至将过量的IPDI去除干净,真空干燥,得白色蜡状至粉末状固体。

    1.5   PEG-PEI嵌段共聚物的合成  

    将PEI用一定量的氯仿溶解,磁力搅拌下将PEG-NCO的氯仿溶液逐滴加入PEI溶液中,再加入0.6%~0.7%的催化剂DBTL,置60 ℃回流反应16 h,将亮黄色溶液浓缩至约50 mL左右,再用大量乙醚沉淀,过滤,真空干燥,称质量。

    1.6   PEG-PEI/DNA复合物的制备 

    根据不同的N/P比,即聚合物中的氨基基团与DNA中的磷酸基团的摩尔比,用PBS制备一定的聚合物溶液,与质粒DNA的PBS溶液混合,涡旋,室温静置30 min,以获得聚合物/DNA复合物。

    1.7   细胞毒性测定(MTT法)

    PEI、PEG-PEI共聚物在100 mL/L胎牛血清的1640培养基中配成不同浓度梯度,分别为1、3、5、10、15、20 μg/mL。将Hela细胞接种到96孔板上,密度为5 000个细胞/孔,细胞培养24 h。吸去每孔中的旧培养液,加入不同浓度的含PEI及PEG-PEI共聚物的培养液,每孔0.2 mL,每个浓度4个复孔,37 ℃,5% CO2 培养箱中培养24 h后更换正常的 RPMI 1640培养液继续培养48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,继续培养4 h,吸尽培养液,每孔加入DMSO溶液150 μL ,在Bio-Tek Elx800型酶标仪490/630 nm波长处读取吸光度值(A),计算细胞活力(%)=实验组A490/630/阴性对照组A490/630×100%。

    1.8   琼脂糖凝胶电泳阻滞试验

    为了证明正电荷的PEI与负电荷的质粒DNA之间的相互作用,采用琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。将DNA与不同浓度的PEI、PEG-PEI共聚物按N/P比分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5,在PBS中形成复合物,室温静置30 min。电泳条件:10 g/L琼脂糖(含0.5 μg/L溴化乙锭),1 × TBE缓冲液,电压80 V,电泳时间40 min。DNA条带在紫外灯下进行观察。

    1.9   粒径和Zeta电位测定

    将DNA与不同浓度的PEI和PEG-PEI共聚物分别按一定的N/P比在PBS中形成复合物,使DNA的终浓度为20 μg/mL,室温静置30 min,在Zetasizer Nano Series 90 粒径分析仪上,测定粒径及Zeta电位。

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