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CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

时间:2017-07-04 12:00:10 来源: 代写硕士论文

              作者:陈波,李建平,戴途,吴志勇,罗蒙,孙勇伟 

【摘要】  目的:构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ,CRBP-1)基因RNAi(RNA interference, RNAi)慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1 基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I 和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:PCR 鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论:成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi 慢病毒载体。

【关键词】  RNA干扰;视黄醇结合蛋白-1;慢病毒

    [Abstract]   Objective:To construct a lentiviral vector of RNA interference(RNAi) of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods:The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed,synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector,to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA), and it was identified by PCR and DNA sequencing. Results:PCR identification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right. Conclusion:The lentivirus RNAi vector of  rat CRBP-I was constructed successfully.

    [Key words]   RNA interference;Cellular retinol-binding protein I;Lentivirus

    肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节[1],在肝纤维化逆转过程中也起重要作用,2002年Uchio K[2]在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现,活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加,而视黄醇脂滴消失,提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。近年来,随着RNAi技术的出现,为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取CRBP-1基因的RNAi 有效靶序列的基础上,设计、构建和鉴定表达CRBP-1 shRNA的慢病毒载体,为后期研究CRBP-1 基因在HSC活化中的作用机制和肝纤维化的基因治疗打下基础。

    1   材料和方法

    1.1   材料   PCR用试剂 primer、dsDNA Oligo (上海吉凯基因技术有限公司合成),大肠杆菌菌株DH5α,DMEM,胎牛血清、胰蛋白酶( Invitrogen 公司)。慢病毒载体系统( Tronolab 公司www. tronolab. com/ lentivectors.php). 该病毒包装系统由pGCL-GFP载体,pHelper 1.0(gag/pol 元件)载体,Helper 2.0 (VSVG元件)载体三质粒组成,其中pGCL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件,同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP),pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包装所必须的元件。 限制性内切酶、T4DNA连接酶(New England Biolabs公司)。

    1.2   方法

    1.2.1   双链DNA Oligo制备   用Ambion 公司的设计软件,设计、合成3 对针对CRBP-1 基因shRNA的寡核苷酸序列,经分别构建质粒,转染293细胞,据其对CRBP-1 的抑制率,确定有效靶序列:Pscsi-1:CCGCAAGTGCATGACCACA,(CRBP-1 mRNA  NM_012733,GenBank GI:77416367). 设计并合成其shRNA的DNA Oligo:Pscsi495-1:5'- CCGGGACC-

    CAAGTGCATGACCACACTCGAGTGTGGTCATGCA-

    CTTGCGGTCTTTTTG-3',Pscsi495-2:5'- AATTGA-

    AAAAGACCGCAAGTGCATGACCACACTCGAGTGT-

    GGTCATGCACTTGCGGTC -3',经退火形成双链DNA。退火反应体系:DNA Oligo(sense) (1μg/μl) 5μl,DNA Oligo(antisense)(1 μg/μl) 5 μl,5×Universal Buffer 20 μl,ddH2O 70 μl。混匀,90℃4 min,70℃ 10 min,缓慢冷却至室温。12%非变性PAGE凝胶检测双链DNA Oligo形成效率。

    1.2.2   构建表达shRNA 慢病毒载体   Hpa I 和Xho I酶切pGCL-GFP载体以使其线性化,经退火形成双链DNA与双酶切后的pGCL-GFP载体连接。连接反应体系:酶切回收的载体DNA(100 ng/μl)1 μl,退火的双链DNA(100 ng/μl)1 μl,10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1 μl,T4噬菌体DNA连接酶1 μl,dd H2O 7 μl,于4℃连接12 h,37℃振摇16 h转化到DH5α。

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